• Intervista al dott. Gilberto Ruffini

    Intervista al dott. Gilberto Ruffini sul Metodo Ruffini. (7 agosto 2016)
    https://www.youtube.com/watch?v=MZNWC_PNKEw&feature=youtu.be
  • L'Ipoclorito di sodio non è solo l 'Amuchina

  • Un approccio di disinfezione aspecifico che mima il sistema immunitario dei vertebrati


    Un approccio di disinfezione aspecifico che mima il sistema immunitario dei vertebrati
    August 2, 2015 - Articolo pubblicato su http://www.scienze-ricerche.it/?p=4784
    di Sergio Ferro, Dipartimento di Scienze Chimiche e Farmaceutiche, Università degli Studi di Ferrara.
     
    Il sistema di difesa del nostro organismo si basa sostanzialmente sull’attività dei leucociti (neutrofili, macrofagi): le cellule estranee vengono dapprima fagocitate e poi distrutte grazie all’azione dell’acido ipocloroso (HOCl), un agente biocida prodotto da un enzima, la mieloperossidasi (MPO), a partire da perossido d’idrogeno e ioni cloruro, durante la cosiddetta esplosione ossidativa (respiratory burst). Il ricorso a tecnologie elettrochimiche avanzate consente di mimare la natura, portando alla sintesi dell’acido ipocloroso, un principio attivo non tossico, non corrosivo e non pericoloso, che può essere utilizzato in numerose applicazioni: dalla disinfezione dell’acqua potabile, all’eliminazione dei microorganismi presenti nelle reti idriche, alla disinfezione di superfici ed ambienti (quest’ultima applicazione richiede la dispersione del principio attivo mediante nebulizzazione). Il presente contributo esamina le peculiarità del processo di disinfezione, ponendo l’accento sull’azione ossidante dell’acido ipocloroso nei confronti dei diversi substrati e fornendo altresì indicazioni sulle modalità più idonee per la sintesi del biocida. Tra le varie applicazioni possibili, la protezione della produzione ortofrutticola (con trattamenti pre- e post-raccolta) e la zootecnia costituiscono settori nei quali l’utilizzo di tecnologie sostenibili è quanto mai desiderabile. I microorganismi (dai termini greci mikros, “piccolo”, e organismós, “organismo”) sono organismi viventi microscopici, a cellula singola o multicellulari. L’esistenza dei microorganismi è stata ipotizzata molti secoli prima della loro effettiva scoperta. Si hanno indicazioni che fanno risalire tali ipotesi addirittura al VI secolo avanti Cristo (Mahavira: 599 AC – 527 AC), ma è stato solo nel 1674, grazie al naturalista olandese Anthony Philips Van Leeuwenhoek che si è avuto modo di osservare forme di vita microbiologiche fino a quel momento mai viste. Van Leeuwenhoek, inventore del primo prototipo di microscopio, riuscì infatti ad osservare i microbi, ovvero ciò che lui originariamente chiamò animalcules.

    Azione dell'acido ipocloroso

    Al fine di sopravvivere in ambienti ostili, molti microorganismi sono in grado di aderire alle superfici, aggregandosi all’interno di una matrice polimerica idrata da loro stessi prodotta; è prassi riferirsi a tali comunità sessili con il termine di biofilm. I biofilm costituiscono un ambiente protetto per la crescita dei microorganismi, e la loro organizzazione e costituzione è tuttora argomento di ricerca. Dal momento che essi mostrano una resistenza intrinseca agli agenti antimicrobici (o biocidi), essi sono alla base di molte infezioni batteriche persistenti e croniche. La resistenza del biofilm agli agenti biocidi è in larga parte dovuta all’incapacità dell’agente biocida di penetrare l’intera estensione della matrice polimerica tridimensionale (Costerton J.W. e altri, 1999). Il problema può essere facilmente compreso considerando l’azione di una qualsiasi specie ossidante: in tali casi, infatti, l’agente antimicrobico viene disattivato ad opera degli strati più esterni del biofilm (in altre parole, la specie ossidante si consuma esercitando la propria attività nei confronti degli strati superficiali della matrice tridimensionale), e questa disattivazione è più rapida della velocità di diffusione dell’agente attraverso le porosità della matrice. Nel novero di tali ossidanti reattivi è possibile includere praticamente tutti gli agenti disinfettanti che vengono solitamente aggiunti all’acqua per combattere i patogeni; a titolo di esempio, si possono nominare il biossido di cloro, l’ipoclorito di sodio, l’ozono, il perossido di idrogeno, le cloro-ammine. In alcuni casi, l’impossibilità di distruggere il biofilm è da ascriversi non solo alla sopra citata scarsa capacità di penetrazione, ma anche ad interazioni elettrostatiche sfavorevoli, che rendono l’avvicinamento e la successiva diffusione del reagente ancora meno efficaci.

    Per discutere dell’efficacia di un agente ossidante contro un biofilm, consideriamo la composizione media di una tale matrice polimerica. E’ innanzitutto opportuno sottolineare che non è né facile né rappresentativo fare riferimento a biofilm specifici: esse, infatti, sono matrici largamente mutevoli, la cui composizione dipende non solo dal tipo di microorganismi, ma anche dalle “condizioni ambientali” in cui un dato microrganismo cresce. Come discusso da Sutherland (Sutherland I.W., 2001), il biofilm è composto principalmente da acqua (la percentuale in termini ponderali può arrivare al 97%), mentre la frazione rimanente comprende cellule microbiche (2-5%), polisaccaridi (1-2%), proteine ed acidi nucleici derivanti da cellule lisate (<1-2%). Per distruggere un biofilm è necessario demolirne la struttura tridimensionale, e tale risultato può essere ovviamente ottenuto eliminando alcuni o tutti i componenti costitutivi. Maggiore è il numero di specie chimiche su cui un dato agente biocida risulta efficace, maggiore è la probabilità di eliminare la comunità sessile.

    La maggior parte degli agenti ossidanti precedentemente citati è solo teoricamente in grado di garantire il risultato desiderato. Come anticipato, alcune specie chimiche vengono respinte a causa di interazioni elettrostatiche repulsive. E’ questo il caso di agenti che presentano una carica negativa, come l’anione ipoclorito. Dal momento che pure la membrana cellulare è caratterizzata da una carica netta negativa, dovuta alla presenza dei cosiddetti gruppi ionogenici, che risultano dissociati ai valori di pH e di forza ionica delle tipiche condizioni fisiologiche (Sherbet G.V. e altri, 1972), un agente ossidante carico negativamente è semplicemente non in grado di entrare in contatto con il suo bersaglio.
    Altri agenti ossidanti possono non essere dotati di carica elettrica (nelle condizioni normalmente considerate, cioè a pH prossimi alla neutralità), ma la loro efficacia può rimanere ancora scarsa a causa di una lenta reattività. E’ questo il caso del perossido d’idrogeno e delle cloro-ammine. Facendo esplicito riferimento al trattamento di acque destinate al consumo umano, un ulteriore aspetto importante è legato al fatto che l’agente biocida deve garantire un’attività residua, il che significa che deve essere non solo efficace ma anche relativamente stabile e persistente nel tempo. Quest’ultima richiesta ridimensiona ulteriormente l’elenco degli agenti ossidanti idonei, depennando l’ozono ed il possibile ricorso alle radiazioni UV. Sulla base delle considerazioni di cui sopra, è possibile intuire le ragioni per cui la maggior parte dei trattamenti di disinfezione dell’acqua potabile si è spostata verso l’utilizzo del biossido di cloro. Tale specie chimica mostra una notevole efficacia contro vari microrganismi, nonché contro il biofilm: infatti, grazie al suo elevato potere ossidante, è in grado di interagire con i diversi componenti della matrice polimerica. Sfortunatamente, il potere ossidante può esercitarsi anche contro i materiali che costituiscono l’impianto idrico (tubi, valvole, serbatoi, caldaie) determinando così problemi di corrosione indesiderati. Inoltre, poiché la sintesi dell’agente disinfettante viene effettuata miscelando idonei prodotti chimici (generalmente si tratta di clorito di sodio ed acido cloridrico, oppure sodio bisolfato), il prodotto di reazione risulta inevitabilmente “contaminato” dai materiali di partenza (ed i cloriti, benché ancora non normati, non sono desiderati nell’acqua potabile).

    Un approccio di disinfezione relativamente nuovo è rappresentato dalle cosiddette soluzioni elettrochimicamente attivate (SEA): l’elettrolisi di soluzioni saline diluite conduce alla sintesi di ossidanti (clorurati o meno) che, per la loro elevata reattività / scarsa stabilità, presentano azione sterilizzante inusuale su cui è possibile contare in una notevole varietà di situazioni (Thorn R.M.S. e altri, 2012). Grazie all’assenza di residui e dell’impossibilità nell’indurre resistenza o fenomeni di assuefazione, queste soluzioni (note anche con il nome “acqua elettrolizzata”) hanno recentemente trovato applicazione nella sanificazione negli ospedali, in zootecnia e nella decontaminazione di effluenti acquosi. Come brevemente discusso nella recente rassegna di Thorn e collaboratori (Thorn R.M.S. e altri, 2012), le soluzioni elettrochimicamente attivate possono essere ottenute con approcci differenti. Le ricerche sono iniziate in Russia nei primi anni ‘70, grazie ai lavori dell’accademico Vitold Bakhir (Bakhir V.M., 1985; Prilutsky V.I. e Bakhir V.M., 1997) che ha ideato un modulo elettrochimico a flusso, basato su elettrodi concentrici separati da una membrana in materiale ceramico (Bakhir V.M. e altri, 1995). La presenza di un separatore tra i compartimenti elettrodici è necessaria quando si vogliono produrre un anolita (soluzione ossidante, generalmente acida) ed un catolita (soluzione riducente, alcalina). Inoltre, un anolita neutro può essere prodotto regolando opportunamente la miscelazione idraulica dei due liquidi citati. In presenza di cloruri, all’anodo del reattore elettrochimico vengono sintetizzati ossigeno (O2) e cloro (Cl2), entrambi in forma gassosa. Una volta formatisi, i due gas seguono strade differenti: mentre l’ossigeno si allontana dall’ambiente di reazione, il cloro è in grado di sciogliersi in acqua, producendo così una soluzione di cloro libero (o attivo). Il pH della soluzione determina quali forme del cloro saranno presenti (acido ipocloroso, HOCl, anione ipoclorito, ClO-, o addirittura cloro gassoso disciolto, Cl2), e rappresenta il fattore chiave per spiegare l’efficacia battericida dell’anolita (Len S.V. e altri, 2000; Abadias M. e altri, 2008; Xiong K. e altri, 2010). L’acido ipocloroso è caratterizzato da un’attività citotossica particolarmente elevata (Hampton M.B. e altri, 1998; Klebanoff S.J., 1999; Winterbourn C.C., 2002) ed in effetti è anche l’agente sintetizzato dai neutrofili (la tipologia più abbondante di globuli bianchi presente nei mammiferi; essi formano una parte essenziale del sistema immunitario dei vertebrati) per uccidere batteri ed altri agenti patogeni. Sfortunatamente, a differenza delle altre forme del cosiddetto cloro attivo (ovvero, l’ipoclorito ed il cloro gassoso), la molecola HOCl è piuttosto instabile, e non può essere conservata per lunghi periodi ed utilizzata al bisogno. Per produrlo, è possibile ricorrere a tre diverse modalità di sintesi (Wang L. e altri, 2007): l’idrolisi del cloro gassoso, l’elettrolisi di soluzioni contenenti cloruri, e l’acidificazione di soluzioni di ipoclorito. Il primo ed il terzo dei metodi citati presentano inconvenienti e pericoli, principalmente connessi con l’uso o l’eventuale rilascio di cloro gassoso. Di conseguenza, il percorso sintetico più semplice e sicuro è rappresentato dalla via elettrochimica, tramite l’elettrolisi di soluzioni diluite di acqua e sale (salamoie).

    Un’analisi critica dei sistemi disponibili sul mercato mostra che soltanto un numero limitato di apparecchiature consente la sintesi di una soluzione biocida in condizioni ben controllate e riproducibili, e la disponibilità di dispositivi utili risulta ulteriormente ridotta quando si introduce il vincolo della sintesi di un prodotto avente un pH prossimo alla neutralità. Quest’ultimo requisito è importante non solo per le ragioni sopra evidenziate (Len S.V. e altri, 2000; Abadias M. e altri, 2008; Xiong K. e altri, 2010), ma anche perché un pH neutro è garanzia di maggiore sicurezza tanto per l’utente quanto per le applicazioni a cui il prodotto è destinato (ad esempio, attraverso una minimizzazione dei problemi di corrosione).

    Comparto catodico

    Per soddisfare tali requisiti, una società italiana (Ecas s.r.l.) ha recentemente brevettato una tecnologia che si basa su un reattore a quattro camere (Bohnstedt R. e altri, 2009), come schematicamente riportato in Figura 1. Esaminando la domanda di brevetto, si comprende che la soluzione in ingresso (avente in genere portate comprese tra 40 e 160L/h, a seconda delle dimensioni del reattore elettrochimico) viene inizialmente ripartita tra due compartimenti catodici, ed è quindi sottoposta ad un solo trattamento catodico. Successivamente, la soluzione viene fatta passare attraverso due trattamenti anodici in serie, che portano alla sintesi del prodotto con le caratteristiche desiderate. Un elemento importante della tecnologia è rappresentato dall’attenzione che è stata dedicata alla scelta dei materiali elettrodici: infatti, alla luce del D.M. 174/2004, taluni materiali non possono essere utilizzati nel trattamento di acque destinate al consumo umano. Con una successiva domanda di brevetto (Quadrelli S. e Ferro S., 2010), la tecnologia è stata ulteriormente migliorata, mutuando i principi dello zero-gap (vale a dire, sistemando gli elettrodi a diretto contatto con la membrana di separazione) dalle tecnologie industriali delle celle a combustibile e del cloro-soda (vedasi ad esempio Lee J.S. e altri, 2006). Tale miglioria costruttiva consente non solo di ridurre la salinità della salamoia diluita (con vantaggi in termini di stabilità dell’anolita e minimizzazione della concentrazione dei prodotti chimici non attivi), ma anche di ridurre il riscaldamento dovuto alla caduta ohmica, cioè alla dissipazione di energia causata dalla presenza di mezzi con resistenza elettrica non trascurabile. In generale, il calore è deleterio tanto da un punto di vista chimico, quanto relativamente alla stabilità degli elettrodi e della membrana.
    Tornando all’efficacia delle soluzioni elettrochimicamente attivate (che può ora essere più esplicitamente attribuita all’efficacia dell’acido ipocloroso), la già citata rassegna di Thorn e collaboratori (Thorn R.M.S. e altri, 2012) riporta evidenze di efficacia contro un impressionante elenco di agenti patogeni. In termini generali, si può dunque affermare che l’acido ipocloroso è un agente biocida aspecifico, potenzialmente in grado di reagire con qualsivoglia substrato organico.
    Con riferimento ai componenti costitutivi del biofilm, le proteine sono substrati abbastanza facilmente ossidabili (tanto i gruppi funzionali ammino, -NH2, e tiolo, -SH, quanto i legami peptidici, -C(=O)-NH-, sono particolarmente sensibili all’ossidazione); anche gli acidi nucleici provenienti da cellule lisate (cioè DNA ed RNA) presentano analoghi siti ossidabili. Tra i costituenti del biofilm, quello che potrebbe sembrare meno incline all’ossidazione è indubbiamente rappresentato dalla famiglia dei polisaccaridi; tuttavia, la letteratura scientifica riporta evidenze sperimentali a supporto del fatto che il cloro attivo (sotto forma di acido ipocloroso) è in grado di condurre ad una mineralizzazione completa delle molecole zuccherine (vale a dire, esse vengono convertite in anidride carbonica ed acqua). Per contro, l’ipoclorito di sodio consente soltanto di addivenire ad una conversione (ossidazione parziale) dei substrati iniziali (Bonfatti F. e altri, 2000).

    In sintesi, la reattività dell’acido ipocloroso rappresenta il principio di base di un moderno approccio di disinfezione, che altro non è che un modo per imitare la natura. Dato che il sistema immunitario dei vertebrati si è sviluppato attraverso migliaia di anni, si può ritenere che tale agente attivo, insieme ad altre specie complesse, sia stato accuratamente selezionato per la lotta contro gli agenti patogeni. Si hanno prove che HOCl agisce anche come una molecola di segnalazione, attivando le difese endogene delle piante (Zarattini M. e altri, 2015), ed è altresì plausibile che esistano somiglianze con il perossido d’idrogeno (che, tra l’altro, è isoelettronico a HOCl), per il quale è stato dimostrato un ruolo di segnalazione singolare nei confronti dei leucociti attivati a seguito di una ferita (Niethammer P. e altri, 2009). Grazie all’efficienza del processo di elettrosintesi, alla mancanza di tossicità e bioaccumulo, le soluzioni elettrochimicamente attivate rappresentano una valida ed ecologica alternativa a molti dei prodotti chimici generalmente utilizzati nella disinfezione (per le acque, gli ambienti e le superfici). E’ altresì ormai comprovata la loro utilità anche in agricoltura: in tale ambito, l’uso delle soluzioni elettrochimicamente attivate consente di ridurre il ricorso ai pesticidi, portando a miglioramenti qualitativi significativi e ad una parallela diminuzione dell’impatto ambientale. Analoghe evidenze sono state infine ottenute in zootecnia, dove l’uso di SEA consente non solo di migliorare la salubrità degli ambienti (allevamenti), con riduzione nell’uso di farmaci (es. antibiotici), ma anche di ridurre in maniera significativa il tasso di mortalità, accrescendo la resa di conversione del cibo fornito agli animali (ciò è primariamente ascrivibile alle migliori condizioni igieniche, che comportano minori problemi di dissenteria e stress, con ovvie ripercussioni sull’aumento in peso dell’animale).

    Riferimenti bibliografici
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    - Zarattini M., M. De Bastiani, G. Bernacchia, S. Ferro e A. De Battisti, The use of electrochemically activated water in crop protection: an approach with optimal efficiency and minimal environmental impact, contributo inviato per la pubblicazione, 2015.

    - (Tratto da: Sergio Ferro, Un approccio di disinfezione aspecifico che mima il sistema immunitario dei vertebrati, in Scienze e Ricerche n. 8, giugno 2015, pp. 73-76)
     

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